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豚鼠血清工艺及应用

发布时间:2022/3/25 9:21:20      阅读次数:323

 背景[1-6]

豚鼠血清经无菌采集、批量混合,最终过3次0.1um过滤分装而成。促细胞生长繁殖的三大指标超过国家标准。本品适合于单抗研制、较常规的原代和传代细胞培养、规模化培养的疫苗生产。

豚鼠血清指血液凝固后,在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。

标准豚鼠血清(无菌未经灭活)的保存应该注意以下几点:

(1)需要长期保存的血清必须储存于-20℃-70℃低温冰箱中.4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月.由于血清结冰时体积会增加约10%,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

(2)热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻的血清.加热过程中须规则摇晃均匀.此热处理的目的是使血清中的补体成分(complement)灭活.除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量.补体参与反应有:细胞毒作用,平滑肌细胞收缩,肥大细胞和血小板释放组胺,增强吞噬作用,促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。

(3)瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃至-70℃低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室温,待全部溶解后再分装.在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生.切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

(4)一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌.如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清。

(5)血清中的沉淀物絮状物:主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量.可用离心3000rpm,5分钟去除,也可不用处理.显微镜下"小黑点":经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多.有些沉淀物在显微镜下观察象"小黑点",常误认为血清受污染.一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。

(6)切勿将血清在37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量.

应用[7][8]

用于豚鼠哮喘模型单个核细胞及嗜酸细胞与肺微血管内皮细胞粘附性的研究观察哮喘豚鼠模型嗜酸细胞和淋巴细胞与肺微血管内皮细胞的粘附率,探讨肺微血管内皮细胞在哮喘模型发病中的功能变化及炎症细胞与其粘附的分子基础。方法:复制豚鼠哮喘模型;分离、培养和鉴定肺微血管内皮细胞;转染核因子(NF)-κB反义寡核苷酸;分别用对照组血清和模型组血清孵育;分离外周血淋巴细胞和嗜酸细胞;采用RT-PCR法测定内皮细胞和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)及嗜酸细胞趋化因子(eotaxin)mRNA的表达强度,EMSA法测定内皮细胞NF-κB、活化蛋白(AP-1)的DNA结合活性。

结果:(1)肺微血管内皮细胞在模型组血清刺激下,与两组外周血淋巴细胞及仅与模型组嗜酸细胞的粘附率显著升高,内皮细胞与嗜酸细胞两者的激活,在嗜酸细胞粘附中起明显的协同作用;(2)肺微血管内皮细胞经模型组血清刺激后,VCAM-1和eotaxin mRNA表达量显著增多,NF-κB、AP-1的DNA结合活性也显著升高。结论:肺微血管内皮细胞可被哮喘模型血清激活,使粘附分子、趋化因子及核转录因子的合成和分泌增多,从而显著提高其与炎症细胞的粘附率,核转录因子NF-κB和AP-1对内皮细胞合成炎症因子可能起调控作用。淋巴细胞与嗜酸细胞的粘附机制不尽相同。

参考文献

[1]Isolation,culture,and characterization of rat lung microvascular endothelial cells.Magee JC,Stone AE,Oldham KT,et al.Am J PhysiolLung Cell Mol Physiol.1994

[2]Interactions between endothelial cells and effector cells in allergic inflammation.Tonnel AB,Gosset P,Molet S,et al.Annals of the New York Academy of Sciences.1996

[3]Comparison of human eosinophil and neutrophil adhesion to endothelial cell under nonstatic conditions.Knol EF,Tackey F,Tedder TF et al.Journal of Immunology.1994

[4]The effect of inhaled sodium cromoglycate on cellular infiltration into the bronchial mucosa and the expression of adhesion molecules in asthmatics.Hoshino M,Nakamura Y.European Respiratory Journal.1997

[5]Association of asthma with serum IgE level and skin-test reactivity to allergens.Burrows B,Martinez FD,Halonen M,et al.The New England Journal of Medicine.1989

[6]Regulation of the development of type 2 T helper cells in allergy.Romagnani S.Current Opinion in Immunology.1994

[7]Th2 and Th2-like cells in allergy and asthma:Pharmacological perspectives.Anderson GP,Coyle AJ.Trends in Pharmacological Sciences.1994

[8]曾泽戎,崔德健,纪晓峰.豚鼠哮喘模型单个核细胞及嗜酸细胞与肺微血管内皮细胞粘附性的研究[J].感染.炎症.修复,2001(03):165-169.

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