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TOP10感受态适用于高效的DNA克隆使用

发布时间:2021/8/9 10:22:16      阅读次数:343

  TOP10感受态是一种用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重级缺陷的抑制型菌株.其中φ801acZΔM15基因的产物可与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补,可用于蓝白斑筛选.该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传.
  保存:所有受体菌均为甘油保存,-70℃可长期保存,-20℃可保存一年.感受态为-70℃保存,运输均为干冰.
  TOP10感受态注意事项:
  1 感受态细胞应保存在-70℃,运输过程中应放入干冰中.
  2 感受态细胞不可反复冻融,否则其转化效率将会降低.
  3 转化时,转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率.转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一.
  4 实验过程中应严格无菌操作,防止其它DNA的污染,避免为以后的筛选 鉴定带来影响.
  5 转化率的计算:转化率=产生菌落的总数/铺板DNA总量6 为防止转化实验不成功,可以保留部分连接产物,以重新转化,将损失降低.
  TOP10感受态操作方法:(以下各步骤均为无菌操作)
  1 将感受态细胞置于冰上融化,如需分装可将刚融化的细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中.一次转化感受态细胞的用量为50-100ul,可以根据实际情况分装使用.以下实验以100ul感受态细胞为例.
  2 向感受态细胞悬液中加入需转化的目的DNA,注意目的DNA的体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一,轻轻旋转离心管以混匀内容物,冰浴放置30分钟.
  3 将离心管置于42℃水浴中放置60-90秒,然后快速转移到冰浴中放置2-3分钟,注意不要摇动离心管.
  4 向离心管中加入500ul无菌无抗的SOC或LB培养基,37℃150rpm振荡培养1小时.目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏.
  5 取适量已转化的感受态细胞涂布含相应抗生素的SOC或LB平板,37℃倒置培养12-16小时.涂布用量可根据具体实验来调整,如转化的DNA总量较多,可取100ul左右的转化产物涂板;反之,如转化的DNA总量较少,可取200-300ul的转化产物涂板.如果预计的克隆较少,可通过离心后吸除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中.涂布剩余的菌液可4℃保存,如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的平板.
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