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GV3101(pJlC SA-rep 感受态

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 产品简介

GV3101(pJIC SA_Rep)菌株为 C58 型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因 Rif,为了便于转 化操作,此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型 Ti 质粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA),此质粒含有 vir 基 因 (vir 基因是 T-DNA 插入植物基因组必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的 T-DNA 转移功 能被破坏,但可以帮助转入的双元载体 T-DNA 顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型 Ti 质粒含有筛选 标签:Gent,赋予 GV3101 菌株庆大霉素抗性;在 GV3101 菌株中转入 help 质粒:pJIC SA_Rep 即为 GV3101(pJIC SA_Rep)菌株,可帮助 pgR106,pgR107,pGreen,pGs2 系列质粒在农杆菌中复制,同时 赋予该菌株四环素(Tet)抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。本公司生产 的 GV3101(pJIC SA_Rep)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,pGs2(卡那霉素抗性)质粒检测转化效 率>105 cfu/μg DNA。

产品组成 组分

CC96308-01 CC96308-02 CC96308-03 GV3101(pJIC SA_Rep) 电转感受态细胞 10 ×50 μL 100 ×50μL

定制 基因型

C58 (RifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( GentR) Nopaline(pJIC SA_Rep -TetR)

存储条件

-80 ℃保存; 请勿将本品置于-20 ℃或者液氮中保存。 质量控制 除胭脂碱型 Ti 质粒 pMP90 和 pJIC SA_Rep 质粒外,无外源质粒 DNA 残留; 电转法转化效率≥105 cfu/μg DNA。

使用方法

1. 将新的 2 mm 电击杯插入冰中预冷;或者将储存于 75%乙醇中的 2 mm 电击杯和杯盖取出,在超净工 作台中将其倒置于干净的吸水纸上,使乙醇充分挥发,然后插入冰中预冷;

2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中待其融化,加入 0.01-1μg 质粒 DNA(体积不大于 5μl),用 200μl 枪头将感受态-质粒混合物快速转移到预冷的电击杯中,盖上杯盖;

3. 开启电转仪,设置参数(2500 V ,200 Ω,25μF),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成后快速插 入冰中,加入 900μl 无抗生素的 YEB 并将感受态细胞转移到无菌空管中,28 ℃振荡培养 2~3 小时。 (注:此电转化参数为 Bio-rad 推荐,使用者也可使用电转仪所推荐的 Protocol 进行操作)

4. 6000 rpm 离心一分钟收菌,留取 100μl 左右上清将菌体轻轻吹匀,并涂布于含相应抗生素的 YEB 平板 上,倒置放于 28℃培养箱培养 2~3 天(当平板只含有 50μg/ml Kan 时,28 ℃培养 48 h 即可;平板中同 时加入 50μg/ml Kan,20μg/ml Rif 时,需 28 ℃培养 60h;如果使用的平板含有 50μg/ml Rif 时,则需要 28 ℃培养 72~90 h)。

注意事项

1. 感受态细胞解冻后应立即使用;

2. 加入的待转化 DNA 的总体积不应超过感受态细胞体积的 1/10;

3. 利福平浓度不应高于 25μg/μl,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率;

4. 由于 Ti 质粒丢失的概率极低(可以忽略),所以相关抗性基因可以不用添加。

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